การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน C-KIT: ความแปรปรวนของ Exon 9 และ Exon 11 ทำให้ตัวรับ KIT ถูกล็อคให้ทำงานตลอดเวลา

ภาพรวม

การตรวจหาการกลายพันธุ์ของ C-KIT มีขึ้นเนื่องจากตัวรับตัวเดียวสามารถเปิดทำงานได้อย่างถาวร บทความนี้จะนำเสนอในมุมมองเชิงกลไกของการทดสอบ: โปรตีน KIT ทำงานอย่างไรเมื่อกลไกควบคุมยังสมบูรณ์, บริเวณรหัสใดที่ทำลายการควบคุมนั้น และเหตุใดตำแหน่งที่แน่นอนของความแปรปรวนจึงเปลี่ยนแปลงวิธีการอ่านรายงานผลการตรวจของห้องปฏิบัติการ

วิธีการทำงาน

KIT เป็นไทโรซีนไคเนสชนิดที่ III ที่เป็นตัวรับ โดยปกติจะสงบนิ่งจนกว่าปัจจัยของสเต็มเซลล์จะจับกับส่วนนอกเซลล์ของมัน ทำให้โมเลกุลตัวรับสองตัวเข้ามาใกล้กัน เพื่อให้โดเมนไคเนสภายในของพวกมันสามารถฟอสโฟรีเลทซึ่งกันและกันและส่งสัญญาณเข้าด้านใน ส่วนที่อยู่ติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ที่เข้ารหัสโดย exon 11 ทำหน้าที่เป็นเบรกในตัว โดยพับกลับเพื่อยึดไคเนสให้อยู่ในรูปร่างที่ยับยั้งตัวเอง การขาดหายไปหรือการแทรกเข้าไปใน exon 11 ทำให้เบรกนั้นบิดเบี้ยว ดังนั้นการจับคู่และการฟอสโฟรีเลทจึงเกิดขึ้นได้โดยไม่มีลิแกนด์อยู่เลย Exon 9 เข้ารหัสส่วนหนึ่งของส่วนต่อประสานการจับคู่ภายนอกเซลล์ และการซ้ำซ้อนที่นั่นจะเลียนแบบรูปร่างที่ถูกลิแกนด์ครอบครอง ความแปรปรวนที่อยู่ใน exon 13 และ 17 อยู่ใกล้กับ ATP pocket และ activation loop ซึ่งปรับเปลี่ยนรูปร่างของตำแหน่งเร่งปฏิกิริยาเอง การทดสอบจะขยายบริเวณเหล่านี้จาก DNA ของเนื้องอกและทำการจัดลำดับ ดังนั้นรายงานผลลัพธ์จึงไม่เพียงแค่ระบุการกลายพันธุ์ แต่ยังระบุส่วนประกอบโครงสร้างที่ล้มเหลวด้วย

ข้อบ่งชี้

การทดสอบจะถูกร้องขอสำหรับเนื้อเยื่อเนื้องอกที่สงสัยว่ามีรอยโรคที่ขับเคลื่อนโดย KIT ซึ่งส่วนใหญ่มักเป็นเนื้องอกในระบบทางเดินอาหาร และเป็นการยืนยันตัวขับเคลื่อนระดับโมเลกุลพร้อมทั้งระบุตำแหน่งไปยัง exon ที่กำหนด เนื่องจาก exon ที่แตกต่างกันส่งผลกระทบต่อส่วนต่างๆ ของตัวรับที่แตกต่างกัน ความละเอียดระดับ exon จึงเป็นผลลัพธ์ที่มีความหมายมากกว่าการระบุเพียงแค่ผลบวกหรือลบ

ข้อกำหนดและการรายงานผล

วัสดุที่ใช้มักจะเป็นบล็อกที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน หรือเนื้อเยื่อเนื้องอกสดที่มีเซลล์ที่ยังมีชีวิตเพียงพอ ห้องปฏิบัติการจะสกัด DNA จีโนม ขยาย exon 9, 11, 13 และ 17 จากนั้นรายงานผลการค้นพบตามมาตรฐาน HGVS nomenclature พร้อมด้วย exon, การเปลี่ยนแปลงโปรตีนที่คาดการณ์ และอัตราส่วนของอัลลีลที่แปรปรวน รายงานฉบับสมบูรณ์จะระบุขีดจำกัดการตรวจจับและแจ้งกรณีที่ปริมาณเนื้องอกต่ำเกินไปที่จะสนับสนุนข้อสรุปเชิงลบที่มั่นใจได้

การจัดเก็บและการจัดหา

บล็อกพาราฟินจะคงตัวที่อุณหภูมิห้องที่ควบคุมได้ ในขณะที่ DNA ที่สกัดจะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20°C หรือต่ำกว่าเพื่อจำกัดการแตกหักในการทดสอบซ้ำ ผู้ซื้อที่จัดการการทดสอบในหลายโรงพยาบาลควรยืนยันรูปแบบตัวอย่างที่ยอมรับได้ ขีดจำกัดอายุของบล็อก และว่าวัสดุที่เหลือจะถูกส่งคืนหรือไม่ เวลาในการตรึงเป็นตัวแปรที่มักจะทำลายคุณภาพการจัดลำดับ ดังนั้นจึงควรอยู่ในข้อตกลงการจัดการตัวอย่าง แทนที่จะปล่อยให้เป็นหน้าที่ของแต่ละไซต์เก็บตัวอย่าง

คำถามที่พบบ่อย

ถาม: Exon ของ KIT ใดบ้างที่รายงานเชิงกลไกต้องครอบคลุม และเหตุใดตำแหน่งของ exon จึงมีความสำคัญ? Exon 9, 11, 13 และ 17 สอดคล้องกับส่วนประกอบโครงสร้างที่แตกต่างกัน: ส่วนต่อประสานการจับคู่, เบรกที่อยู่ติดกับเยื่อหุ้มเซลล์, ATP pocket และ activation loop การระบุ exon จะบอกผู้อ่านว่ากลไกควบคุมใดที่ล้มเหลว ซึ่งเป็นข้อมูลที่ผลบวกเพียงอย่างเดียวไม่สามารถให้ได้

ถาม: ห้องปฏิบัติการแยกตัวขับเคลื่อนที่กระตุ้นอย่างแท้จริงออกจากความแปรปรวนที่เกิดขึ้นโดยบังเอิญได้อย่างไร? การตีความจะรวมตำแหน่งของความแปรปรวนภายในจุดร้อนที่กระตุ้นซึ่งได้รับการจำแนกประเภท, อัตราส่วนอัลลีลเมื่อเทียบกับปริมาณเนื้องอกโดยประมาณ และหลักฐานการทำงานที่ตีพิมพ์ ความแปรปรวนนอกบริเวณที่จำแนกประเภทมักจะรายงานว่าเป็นความไม่แน่นอน แทนที่จะสันนิษฐานว่ากระตุ้น

ถาม: สภาพตัวอย่างใดที่รักษา DNA ของ KIT ได้ดีที่สุดสำหรับการจัดลำดับ? การตรึงด้วยฟอร์มาลินที่สั้นและควบคุมได้ ตามด้วยการฝังในพาราฟินอย่างรวดเร็ว จะรักษาชิ้นส่วนที่สามารถขยายได้ การตรึงที่นานเกินไปหรือตัวอย่างที่ผ่านการกำจัดแคลเซียมจะทำให้ DNA เสื่อมสภาพและเพิ่มโอกาสในการทดสอบที่ไม่ให้ข้อมูล